半岛体育 半岛官网仪器分析总结 一、基础内容 （一）绪论 化学分析是指利用化学反应和它的计量关系来确定被测物质组成和含量的一类分析方法。 仪器分析是指通过物质某些物理或者物理化学性质、参数及其变化来确定物质的组成、成分含量及化学结构的分析方法。 分析仪器是仪器分析方法的技术设备，包括通用分析仪器和专用分析、测量一起两大类。 仪器分析的特点： 试样用量少，适用于微量、半微量乃至超微量分析； 检测灵敏度高，最低检出量和检出浓度大大降低； 重现性好，分析速度快，操作简便，易于实现自动化、信息化和在线检测； 化学分析需要在溶液中进行，仪器分析可在物质原始状态下分析； 可实现复杂混合物成分分离、鉴定或者结构测定； 相对误差较化学分析误差较高，达3~5%，不适合常量和高含量分析； 需要结构复杂的分析仪器，分析成本较高。 分析方法类型：1、光化学分析法；2、电化学分析法；3、分离分析法；4、其他仪器分析法。 分析仪器的性能指标：精密度、灵敏度、检出限、动态范围、选择性、响应速度、分辨率。 （二）电化学分析法 电化学分析导论 被测样品：溶液 分析对象：具体物种（分子、离子） 分析方法：是将待测试液与适当的电极组成一个化学电池，通过测量电池的某些物理量，如电位、电流、电导或电量等来确定物质的组成和含量或测定某些电化学性质。 电解池：由外加电源强制发生电池反应，以外部供给的电能转变为电池反应产物的化学能，在反应中有电荷在金属/溶液界面上转移，电子转移引起的氧化或还原反应发生。并遵循Faraday电解定律，称为Faraday过程。 非Faraday过程：由于热力学或动力学方面的原因，可能没有电荷转移反应发生，而仅仅发生吸附和脱附的过程，使电极/溶液界面的结构可以随电位或溶液组成的变化而改变。 电极过程：电极和溶液界面上发生一系列变化的总和。 电极过程的基本历程： 液相物质传递步骤； 前置的表面转化步骤 电子传递步骤 随后的表面转化步骤 物质传递步骤 极化现象：当有电流通过电极时，总的反应速率不为零，即原有的热力学平衡被破坏，致使电极电位偏离平衡电位的现象 电化学电池中的电极系统： 工作电极：实验中要研究或考察的电极，它在电化学池中能发生所期待的电化学反应，或者对激励信号能做出响应的电极 参比电极：在测量过程中其电位几乎不发生变化的电极 辅助电极（又称对电极）：提供电子传导的场所，与工作电极、参比电极、组成三个电极系统的电池，并与工作电极形成电流通路 电分析化学方法： 静态方法：平衡态或非极化条件下的测量方法，如电位法、电位滴定法 动态方法：有电流通过或极化条件下的测量方法，如伏安法、计时电位法 伏安法：指用电极电解被测物质溶液，根据所得到的电流—电压曲线来进行分析的方法 电位分析法：将一个指示电极和一个参比电极，或者采用两个指示电极，与试液组成电池，然后根据电池电动势或者指示电极电位的变化来进行分析的方法（电位法、电位滴定法） 电重量法：使用外加电源电解试液，电解完成后直接称量电极上析出的被测物质的质量来进行分析的方法 电离分离法：将电解的方法用于物质的分离 库仑分析法：根据电解过程中所消耗的电荷量来进行分析（分控制电流库仑分析法和控制电位库仑分析法） 电导分析法：根据溶液的电导性来进行分析的方法（包括电导法和电导滴定法） 电分析化学方法的特点：分析速度快；灵敏度高；所需试样量少，所使用的仪器简单，易于控制；适用于进行微量操作；可用于各种化学平衡常数的测定以及化学反应机理的研究。 电位分析法 电位分析法：电位法、电位滴定法 电位法一般使用专用的指示电极，把被测离子的活（浓）度通过毫伏电位计显示为电位读数，再有能斯特方程计算求其活度；电位滴定法类似于化学滴定法，是利用电极电位在化学计量点附近的突变来代替指示剂的颜色变化来确定滴定终点。被测物质含量的求取和化学滴定法完全相同 电位分析法指示电极的分类： 第一类电极：金属电极与其金属离子溶液组成的体系，其电极电位决定于该金属离子的活度 第二类电极：金属及其难溶盐（或络离子）所组成的电极体系 第三类电极：金属与两种具有共同银离子的难溶盐或难解离的络离子组成的电极体系 零类电极：惰性金属电极，Pt、Au、C等 膜电极：离子选择电极 电位选择系数：电极对各种离子的选择性，用电位选择系数来表示，为一常数 参比电极和盐桥 参比电极基本性质：1、可逆性；2、重现型；3、稳定性 分类：标准氢电极、甘汞电极和银—氯化银电极 盐桥作用：接通电路，消除或减小液接电位 使用条件：1、盐桥中电解质不含有被测离子；2、电解质的正负离子的迁移率应该基本相等；3、要保持盐桥内离子浓度尽可能的大，以保证减小液接电位 扩散电位：由于离子扩散速度的不同造成的电位差 离子选择电极电位=内参比电极+膜电位 离子选择电极类型： 玻璃电极 晶体膜电极：I）、氟离子单晶膜电极；II)、硫、卤素离子电极 流动载体电极：液膜电极 气敏电极：一种气体传感器，测定溶液或其他介质中气体的含量 生物电极：一种将生物化学和电化学原理结合而制成的电极（分为酶电极、离子敏感场效应晶体管、组织电极） 响应时间：从离子选择电极与参比电极一起与试液接触时算起，直至电池电动势达到稳定值时为止，在此期间所经过的时间为实际响应时间 分析方法：直接比较法、校准曲线法、标准加入法 电位滴定法 滴定终点的确定：滴定反应发生时，在化学计量点附近，由于被滴定物质的浓度发生突变，指示电极的电位随之产生突越，由此确定滴定终点 滴定反应类型以及指示电极的选择 酸碱反应可用pH玻璃电极作指示电极 氧化还原反应在滴定过程中，溶液中氧化态和还原态的浓度比值发生变化，可采用零类电极作指示电极，一般都用铂电极 沉淀反应滴定可根据不同的沉淀反应，选用不同的指示电极 络合反应用EDTA进行电位滴定时，可采用两种类型的指示电极；一是应用于个别反应的指示电极；另一种能够指示多种金属离子的电极，谓之pM电极 伏安法与极谱法 液相传质方式：对流、电迁移、扩散 直流直谱装置：以滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极组成的电解池 干扰电流及其消除方法: 残余电流：来源于微量杂志的氧化还原所产生的电流，采用作图法加以扣除 迁移电流：加入大量支持电解质可以消除 极谱极大：在电流—电位曲线上出现的比扩散电流要大得多的突发电流峰：通常采用加入表面活性剂来抑制 氧电流：通入惰性气体，或在中性或碱性溶液中加入亚硫酸钠，强酸中加入碳酸钠或铁粉，从而消除氧的电流干扰 脉冲极谱：方波极谱法、常规脉冲极谱法、示差脉冲极谱法 伏安法：线性扫描伏安法、循环伏安法、溶出伏安法、 单扫描极谱法（示波极谱法）特点 在汞滴的生长后期施加线性扫描电压，且扫描速度快 在阴极射线示波器记录电流—电位曲线 在一滴汞生长周期内完成一个极谱波的测定 循环伏安法（三角波电位扫描）：从其实电位Ei开始，线性扫描到终止电位Et后，再扫描到起始电位 溶出伏安法：先将被测物质以某种方式富集在电极表面，而后借助线性电位扫描或脉冲技术将电极表面富集物质溶出根据溶出过程得到的电流—电位曲线来进行分析的方法（阳极溶出伏安法、阴极溶出伏安法、吸附溶出伏安法、） 伏安法常用的电极：汞电极、碳电极、金属电极、化学修饰电极 电解和库仑法 过电压指工频下交流电压均方根值升高，超过额定值的10%，并且持续时间大于1分钟的长时间电压变动现象过电位电极的电位差值，无电流通过（平衡状态下）和有电流通过之电位差值。(第一激发态)直接跃迁到基态时所辐射的谱线称为第一共振线（不同元素的特征谱线）。用来进行光谱分析的谱线叫做分析线，分析线常常选用灵敏线或最后线。 灵敏线：是各元素中最容易激发或激发电位较低，跃迁几率较大的谱线。灵敏线大多是一些共振线。 定性分析：各种元素都有自己的特征谱线组→识别各元素的特征谱线→鉴定元素的存在。 定量分析：谱线的强度→测定元素的含量。 原子发射光谱法定义：原子发射光谱分析(AES)是根据原子所发射的光谱来测定物质的化学组成的分析方法。 原子发射光谱分析的特点： 光谱定性分析可靠、灵敏、快速、 简便、应用范围广。周期表上约七十个元素可以用光谱方法较容易地定性鉴 定，这是光谱分折的突出应用。 ●在多数情况下，分析前不必把待分析的元素从基体元素中分离出来。 ●一次分析可以同时测得样品中多种元素的含量。 ●消耗试样量很少，并具有很高的灵敏度。 ●适宜于作低含量及痕量元素的分折。 ●不适合分析有机物及大部分非金属元素。 原子发射光谱法的过程： 由光源提供能量使试样蒸发，形成气态原子，并进一步使原子激发产生光辐射→将光源发出的复合光排列成谱线，形成光谱→用检测器检测谱线的强度和波长 影响谱线强度的因素有：统计权重、跃迁概率、激发能、激发温度、基态原子数 自吸现象：原子在高温时被激发，发射某一波长的谱线，而处于低温状态的同类原子又能吸收这一波长的辐射的现象 自蚀现象：当自吸现象非常严重时，谱线中心的辐射讲完全被吸收的现象 共振变宽：由于同类原子的相互碰撞引起的谱线变宽现象 使电极之间的气体电离的方法：紫外线照射、电子轰击、电子或离子对中性原子碰撞以及金属灼热时发射电子等 击穿：当电极间的电压增大到某一定值时，电极间的电阻突然变得很小的现象 自持放电：在电极间的气体被击穿后，即使没有外界电离作用，仍然继续保持电离，使放电持续的现象 ICP—电感耦合等离子体的特点： 1、检出限低；2、稳定性好、精密度高、准确度高；3、自吸效应、基体效应小；4、选择合适的观测高度，光谱背景小； 缺点：在于对非金属测定灵敏度低，仪器价格昂贵，维持费用较高 试样引进激发光源方式： 溶液试样：一般采用气动雾化（同心型、直角型、特殊型）、超生雾化和电热蒸发方式 气体试样：直接引入 固体试样：1、试样直接插入进样；2、电弧和火花熔融法；3、电热蒸发进样；4、激光熔法 原子吸收光谱法 定义：AAS是基于物质产生的原子蒸气对特定的谱线（通常是待测元素的特征谱线）的吸收作用来进行定量分析的一种方法。 原子吸收光谱谱线变宽的因素：自然宽度、Doppler变宽（热变宽）、碰撞变宽（Lorentz洛伦兹变宽、Holtsmark霍尔茨马克变宽）、场致变宽、自吸变宽 原子吸收光谱法特点：选择性好、灵敏度高、精密度高、操作方便和快捷、应用范围广 缺点：光源单一，不适宜用于多元素混合物的定性分析，对于高熔点、形成氧化物、形成复合物或形成碳化物后难以原子化元素的分析灵敏度极低。 原子吸收光谱和原子发射光谱的比较 1.原子吸收法的选择性高，干扰较少且易于克服。 由于原于的吸收线比发射线的数目少得多，这样谱线重叠的几率小得多。而且空心阴极灯一般并不发射那些邻近波长的辐射线经，因此其它辐射线.原子吸收具有较高的灵敏度。 在原子吸收法的实验条件下，原子蒸气中基态原于数比激发态原子数多得多，所以测定的是大部分原子。 3.原子吸收法比发射法具有更佳的信噪比。 这是由于激发态原子数的温度系数显著大于基态原子。 原子吸收分光光度计的基本构造：光源、原子化系统、分光系统、检测系统 1.光源——空心阴极灯 ☆能发射待测元素的共振线、比吸收光谱线更窄的锐线光谱，光的强度稳定且背景小。 空极阴极灯的发光强度与工作电流有关。 使用灯电流过小，放电不稳定；灯电流过大，溅射作用增强，原子蒸气密度增大，谱线变宽，甚至引起自吸，导致测定灵敏度降低，灯寿命缩短。因此在实际工作中应选择合适的工作电流。 为了获得稳定的发射强度，在使用前要进行预热，根据不同元素灯的性质预热时间也不同，一般在5~10分钟。 2.原子化系统 原子吸收光谱法常用的原子化系统：火焰原子化系统，石墨炉子原子化系统和低温原子化系统 火焰原子化系统 结构：雾化器、预混合室、燃烧器及其高度控制、燃气与助燃气气路控制系统 特点：适用范围广，分析操作简单，分析速度快、分析成本低 缺点：同轴雾化器雾化效率低，所需试样溶液体积较大、火焰原子化效率低伴随复杂的火焰反应、原子蒸气在光程中滞留时间短，燃气和助燃气体稀释作用限制了方法检出限的降低，而且只能分析液体试样 石墨炉原子化系统 结构：电源、炉体、石墨管 石墨炉原子化法（电热原子化法）特点：采用直接进样和程序升温方式可达3500℃，升温速度快，绝对灵敏度高，可分析元素种类多，所用试样少， 缺点：分析速度较慢，分析成本高，背景吸收、光辐射和基体干扰比较大 （3）低温原子化法（化学原子化法）：冷原子化法和氢化物发生法 原子吸收分光光度计的性能指标： 1、光学系统的波长显示值误差； 2、光学系统分辨率； 3、基线、检出限； 干扰及其消除 物理干扰：试样溶液物理性质变化而引起吸收信号强度变化，属于非选择性干扰 减少或消除的办法： 1、配置与待测试样溶液基体相一只的标准溶液； 2、当配置与待测试样溶液基体相一致的标准溶液有困难时，采用标准加入法； 3、被测试样溶液中元素的浓度较高时，采用稀释方法 化学干扰属选择性干扰； 消除办法：1、改变火焰类型；2、改变火焰特性；3、加入释放剂；4、加入保护剂；5、加入缓冲剂；6、采用标准加入法 电离干扰：由于电离能较低的碱金属和见图金属元素在原子化过程中产生电离而使基态原子数减少，导致吸光度下降； 减少的方法：加入电离能较低的消电离剂、利用强还原性富燃火焰、采用标准加入法、提高金属元素的总浓度 光谱干扰： 当光谱通带内存在其他谱线，分子吸收和光散射也属于光谱干扰 减少吸收线重叠干扰方法：选用较小的光谱通带；选用被测元素的其他分析线；预先分离干扰元素 减少直流发射光谱干扰方法：采用锐线光源的电源调制技术 减少非吸收线光谱干扰方法：选用较小的光谱通带；选用较小HCL灯电流 仪器操作条件的选择：1、HCL电流选择；2、吸收谱线、光谱通带的选择 火焰原子化法最佳条件选择： 1、火焰的类型与特性选择； 2、燃烧器高度的选择； 3、火焰原子化器的吸喷速率 石墨炉原子化法最佳条件选择： 石墨管类型的选择； 2、升温程序的选择； 3、基体改进剂选择； 4、进样量的选择； 紫外-可见光分光光度法 单色光——具有相同能量（相同波长）的光。 混合光（复合光）——具有不同能量（不同波长）的光复合在一起。 互补色： λmax（最大吸收波长）——吸收曲线中，吸光度最大处的波长，是定性鉴别物质的基础。 吸收曲线——以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标作图所得曲线。 光吸收具有选择性和加和性。 红外吸收光谱法 红外光谱——又称为分子振动转动光谱，当样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收某些频率的辐射，并由其振动运动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生的分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，从而形成的分子吸收光谱。一般指有机物质在4000~400cm-1红外线的照射下，选择性的吸收其中某些频率后，用红外光谱仪记录所形成的吸收谱带。特点： 1）红外吸收只有振-转跃迁，能量低； 2）应用范围广； 3）分子结构更为精细的表征； 4）固、液、气态样均可用，且用量少、不破坏样品； 6）分析速度快； 7）与色谱等联用具有强大的定性功能。 红外活性分子——产生红外吸收的分子，如非对称分子。反之为非红外活性分子，如对称分子。 伸缩振动——原子沿键轴方向伸缩，键长发生变化而键角不变的振动。分为对称伸缩振动(νs)和不对称伸缩振动(νas)。 变形振动(δ)——又称弯曲振动或变角振动，基团键角发生周期变化而键长不变的振动。分为面内变形振动和面外变形振动。 产生吸收峰的条件 ：只有偶极矩大小或方向有一定改变的振动才能吸收红外光而发生振动能级跃迁。线种振动方式，非线种。 产生红外光谱的两个条件： 1．辐射应具有能满足物质产生振动跃迁所需的能量； 2．辐射与物质间有相互偶合作用。 红外光谱三要素：峰位、峰强、峰形。 红外谱带位移影响因素： 1.诱导效应与共轭效应 2.键应力效应（张力效应） 3.空间效应 4.氢键效应 5.振动偶合与费米共振 6.物态变化 7.溶剂影响 红外光谱的最大特点是具有特征性。 基团频率——与一定的结构单元相联系的振动频率。 核磁共振波谱法 核磁共振定量分析的基础是结构分析。 优点：定性测定不具有破坏性，定量测定不需标样，灵敏度、精确度、准确度及分析速度高。 核磁共振谱定量分析的基础：各化学环境不同的质子吸收蜂的面积，只与所包含的质子数有关，可直接根据各共振峰积分值的比值推算所代表的各自旋核的数量。 NMR定量方法： 1、要求： 1.被测物质的结构必须是已知； 2.核磁共振谱线.理想的被测信号是多个质子的单蜂； 4.信号两端的基线.内标绝对测定法 常用内标：六甲基环三硅氧烷和六甲基环三硅胺 2.外标绝对测定法 样品和外标分别放置在两只核磁管中测定，二管直径必须相同，最好使用同一支样品管。 样品和外标必须交叉重复测定以提高分析的准确性。 3.相对含量测定法 被测样品是由若干已知化合物组成，如果没有合适的内标化合物时，可采用以其中一个组分做“标样”。 4.峰高定量法 通过求出样品中某组质子的峰高，求出样品的含量。 峰高与自旋-自旋弛豫常数有关，而后者与化合物的类型有关，受局部磁场的影响，故不能直接用于定量。被积信号过于接近而无法准确测定各质子峰积分面积时，可考虑用峰高法进行定量分析，通过实验求出峰高与含量之间的关系，校正误差。 （四）质谱法 质谱仪：进样系统、离子源、质量分析器、检测器、计算机系统 药用植物中的组分提取分析： 低极性组分——GC-MS 大极性组分、生物大分子——HPLC-MS 蛋白质测定：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS） 、电喷雾质谱（ESI-MS）。 蛋白质分子量测定： 1、多肽与蛋白质的ESI-MS分析采用正离子方式进行，ESI-MS可以产生多电荷离子峰使检测的分子质量范围扩大。 2、ESI-MS得到的是一簇多电荷的质谱峰群，相邻两簇质谱峰之间电荷数差1。 3、 P：多电荷离子质荷比，Mr：蛋白质分子量，Ma：正离子分子量（来源为氢时，Ma=1.0079），Z：多电荷离子带电量 故，Mr=(P-Ma)Z=(P-1)Z 4、高分辨质谱求电荷数： ，P、P’：相邻同位素峰的质荷比 蛋白质鉴定：肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽测序 肽质量指纹谱(PMF)——蛋白质的氨基酸序列经酶解为肽段序列，所测得的肽混合物质量数即称为肽质量指纹谱。 （五）色谱法 色谱法导论 色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分与固定相和流动相的作用力不同而达到分离目的。 色谱流出曲线或色谱图——样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。 基线——实验条件下，样品加入色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线，反映了S/N（信噪比）大小的稳定性的水平直线。 峰高——色谱峰顶点与基线 )——不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，与色谱柱的空隙体积成正比。 流动相平均流速： ，L为柱长 2、保留时间(tR )——试样从进样到出现峰极大值时的时间。包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。保留时间为色谱定性依据，但同一组份的保留时间还与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。 3、调整保留时间(t’R )——某组份的保留时间扣除死时间后的时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即t’R = tR - t0 4、死体积(V0)——色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。V0=t0Fco，Fco：柱出口的载气流速(ml/min) 5、保留体积(VR)——从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 6、调整保留体积(V’R)——某组份的保留体积扣除死体积后的体积。即V’R = VR - V0 7、相对保留值(r2,1)——组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长、填充情况及流动相流速无关，又称选择因子或者分离因子α：反映两组分间的分离情况，α=1，则两组分无法分离，而α越大则分离越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。 区域宽度： 1、标准偏差σ——峰高0.607处的峰宽的一半。 2、半峰宽W1/2——峰高一半处的峰宽。 3、峰（底）宽W——色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。 色谱流出曲线的意义： 色谱峰数——样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。 分配系数K——一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值。 分配比（容量因子或者保留因子）k——一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相质量的比值。 塔板理论假定： 1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达到平衡（达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H）； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入（以一个一个的塔板体积加入）。 当塔板数n较少时，组分流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。 速率理论认为： 单个组分粒子在色谱柱内的运动是高度不规则的、随机的，在柱中随流动相前进的速度是不均一的。塔板理论研究的是平衡态，速率理论则从动态角度出发，提出改变色谱条件、控制流速、提高分离效率的理论。 色谱分离条件选择： 1、两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数（k）决定，即由色谱过程的热力学性质决定。 2、每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散（H或n）决定，即由色谱过程动力学性质决定。 气相色谱法 气相色谱仪：载气系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、记录系统 固定液的选择——相似性原则；组分极性差别较大选用极性固定液，沸点差别较大选用非极性固定液。 被分离物质 固定液 主要作用力 出峰顺序 非极性 非极性 色散力 按沸点顺序，沸点低者先出柱。 相同沸点的极性组分先出。 中等极性 中等极性 诱导力和色散力 按沸点顺序，沸点低者先出柱。 相同沸点的极性组分后出。 极性 极性 静电力 按极性顺序出柱，非极性组分先出柱。 能形成氢键的试样 氢键型 氢键力 按形成氢键的能力大小出柱。 常用检测器 浓度型 热导检测器(TCD) 有机和无机，适用范围广；一般氢气作载气，氮气灵敏度差 电子捕获检测器(ECD) 只对含有电负性强元素的物质有响应；氮气作载气 质量型 氢焰离子化检测器(FID) 仅用于有机物检测；氮气作载气，氢气作燃气，空气助燃 流量关系一般为，N2:H2:Air为1:1~1.5:10 火焰光度检测器(FPD) 氦气 热离子化检测器(TID) 氦气、氮气 速率理论应用 1、（A=2λdp）减小A：粒度较细，颗粒均匀， 一般为60~80目或80~100目的填料。 2、（B=2γDg）减小B：载气线速度较低时用氮气，较高时宜用氦气或氢气；较低的柱温。 （1）填充柱γ1，空心毛细管柱γ＝1。 （2）Dg与载气的分子量的平方根成反比，随柱温升高而增大，随柱压增大而减小。 3、减小C：固定相的液膜厚度要薄；组分在液相中的扩散系数要大。 分离度R应用 1、增大k：峰间隔变大。 2、增大n：峰宽变窄。 色谱柱评价： 1、色谱柱效率——峰尖 评价：理论板高(H)、理论塔板数(n) 对策：将Van Deemter 各因素优化 2、选择性——峰的分离度 评价：分离因子或分离度(R) 对策：选择极性相当的固定相 3、峰的对称性——吸附现象 评价：拖尾因子(f) 对策：色谱柱进一步老化 柱温选择原则：不超过固定液最高使用温度；在良好分离前提下，尽可能采用低柱温。 柱长选择原则：在达到一定分离度的条件下，应使用尽可能短的柱。 其他条件： 1、气化室温度等于或稍高于试样的沸点，不超过沸点50℃以上，高于柱温30℃~50℃。 2、检测室温度高于或至少等于柱温。 3、进样速度快，试样不超载。 定量分析的依据：在恒定的实验条件下，峰面积（或峰高）与组分的（含）量成正比。 同一检测器对不同物质具有不同的响应灵敏度。（需要校正） 定量分析方法： 外标法——校正曲线法和外标一点法 内标法——校正曲线法和内标一点法 气相色谱与液相色谱的比较 1、流动相 GC用气体做流动相（载气），常用载气（氮气、氦气和氢气）种类少，可选择范围小，对分离影响小；LC中，流动相种类多，对分离结果贡献大。 2、固定相 GC一般选定一种载气，然后通过改变色谱柱（固定相）以及操作参数（柱温和载气流速）来优化分离；LC则往往是选定色谱柱后，通过改变流动相的种类、组成以及操作参数（柱温）来优化分离。 3、分析对象 GC分离的样品可挥发且热稳定，沸点一般不超过450度。已知化合物中，有20~25%可用GC直接分析，其余原则上可用LC分析。 4、检测设备不同 5、制备分离 GC收集馏分后载气很容易除去，原理上有优势，但由于其柱容量远不及LC，故实用价值很有限，而制备LC则有很广泛的应用。 高效液相色谱法 高效液相色谱法（HPLC）——在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点。 （I）HPLC与经典LC比较 主要区别：固定相、输液设备和检测手段的差别 1．经典LC： 仅做为一种分离手段；柱内径1~3cm，固定相粒径100μm且不均匀；常压输送流动相；柱效低；分析周期长；无法在线、HPLC： 可用于分离和分析；柱内径2~6mm，固定相粒径10μm且均匀；高压输送流动相，分析速度快；柱效高；采用高灵敏度检测器，分析时间大大缩短；可以在线检测。 （II）HPLC与GC比较 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 区别：分析对象和流动相的差别 1、GC： 分析可气化、热稳定性好且沸点较低的样品；采用惰性气体为流动相，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用；实验过程常需加温。 2、HPLC： 分析样品范围广，不受样品挥发性和热稳定性的影响；流动相为液体，种类较多，选择余地广；一般常温进行。 HPLC分类： 按固定相的聚集状态分为液液色谱法（LLC）和液固色谱法（LSC）； 按分离机制分为分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法； 最常见的是化学键合相色谱法、离子抑制色谱法、离子对色谱法等，其他如亲和色谱法、手性色谱法、胶束色谱法和电色谱法等。 化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法，适用于分离几乎所有类型的化合物，是应用最广的色谱法。其均一性和稳定性好；柱效高，重现性好；分离选择性高。 化学键合相：采用化学反应的方法，将官能团键合在载体表面所形成的固定相。具有使用过程中不流失、化学稳定性好、适于梯度洗脱、载样量大等特点。但流动相的pH应在其相应使用范围内，如2~8，否则硅胶会被溶解；按极性可分为非极性、弱极性和极性三类。非极性键合相：表面基团为非极性烃基，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）和苯基等，最常用是C18（ODS）。一般来说，长链烷基可使得样品保留时间延长，分离的选择性增加，且载样量提高，稳定性好。弱极性键合相：常见的有醚基和二羟基键合相，使用较少。极性键合相：常用的有氨基和氰基键合相。 化学键合相色谱法可分为正相色谱法和反相色谱法，最常用的是反相色谱法。 正相键合相色谱法以极性键合相为固定相，如氰基（-CN）、氨基（-NH2）等，并以非极性或弱极性溶剂为流动相，如各种烷烃等，即固定相极性大于流动相极性。主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。 反相键合相色谱法以非极性键合相为固定相，如十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等，有时也用弱极性或中等极性的键合相为固定相，流动相则以水为基础溶剂，再加入一些与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙腈等，以调整流动相的极性比例，即固定相极性小于流动相极性的色谱法。适合于分离非极性或弱极性化合物，可用于分子型化合物及离子型或可离子化的化合物（加入抑制剂）的分离。 极性键合相的分离选择性决定于键合相的种类、流动相的强度和样品的性质。 1、正相键合相色谱中，组分极性越强，吸附越牢，越后洗脱出柱；固定相极性增加，组分保留时间变大，洗脱减慢；流动相极性增加，洗脱能力增强，组分保留时间变小，洗脱加快。一般情况下分离含双键的化合物常用氰基键合相，而分离多官能团化合物则用氨基键合相；流动相常以饱和烷烃加极性调节剂的方式组成。 2、反相键合相色谱中，组分极性越弱，疏水性越强，与固定相的亲和力越大，越后洗脱出柱；流动相极性越小，洗脱能力越强，保留时间越短（水增多，保留时间增加）。以长链烷基组成的键合相适合分离非极性化合物，短链烷基键合相则能用于分离部分极性化合物，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物等。 HPLC固定相：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 HPLC流动相：不与固定相发生化学反应；对样品有适宜的溶解度；必须与检测器相适应；纯度要高，粘度要小。使用前，需用微孔滤膜过滤，同时还要脱气。 在正相和反相色谱中，流动相极性强弱与洗脱能力是相反的——相似相溶 HPLC速率方程：H=A+Cmu+Csmu，降低流速，可增加H，但流速太低，分析时间长。 传质过程——组分在固定相和流动相间不断的溶解、扩散、转移的过程。影响此过程进行的阻力称为传质阻抗。为降低流动相的传质阻抗，应降低固定相的粒度，同时选用粘度比较小的流动相，使得分子扩散比较容易。在实验中常用粘度比较低的甲醇或乙腈，而少用粘度比较大的乙醇。 HPLC仪器主要由输液系统（高压输液泵以及在线脱气和梯度洗脱装置）、进样系统（手动进样阀或自动进样器）、色谱柱系统（色谱柱以及柱温箱）、检测系统和数据记录处理系统组成，制备型HPLC还备有自动馏分收集装置。HPLC的三大关键部件：输液泵、色谱柱、检测器。 等度洗脱——在同一分析周期内流动相组成保持恒定的洗脱方式。该法适合于组分数目少，性质差别不大的样品的分离分析。 梯度洗脱——在一个分析周期内可以程序改变流动相组成的洗脱方式。该法适合分析组分数目多，性质相差较大的复杂样品的分离分析。梯度洗脱可以缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度，但是可能引起基线漂移和重现性降低。根据具体情况，可将等度洗脱和梯度洗脱结合起来。 线性梯度洗脱是常用梯度洗脱方式，即在一个分析周期内，流动相随时间均匀线性变化。 梯度洗脱有两种装置：高压梯度和低压梯度。 选择性（专属型）检测器：紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器（安培检测器）。其只能检测某一组分的某一性质，响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。 通用型检测器：示差折光检测器和蒸发光散射检测器。检测是一般物质都具有的性质，对所有的化合物均有响应。 HPLC的定性分析方法可以分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法，后者又分为化学鉴定法和两谱联用鉴定法。 色谱的定量分析需要色谱系统符合一定要求，即要进行色谱系统适用性实验，包括理论塔板数、分离度、峰对称因子、重复性等参数，其中分离度和重复性最具实用意义。 HPLC定量分析方法： 1、外标法——以对照品的量对比求算样品含量的方法。可分为校正曲线法、外标一点法及外标两点法等。 2、内标法——以待测组分和内标物的峰高或峰面积比求算含量的方法。可分为校正曲线法、内标一点法、内标两点法和校正因子法等。 3、内加法——将待测组分的对照品加至待测样品溶液中，测定增加对照品后的溶液比原样品溶液中组

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